Năm 1974, bà tham gia hoạt động bí mật thuộc Ban binh vận Sài Gòn Gia Định.[5]

Được kết nạp vào Đảng Cộng sản Việt Nam ngày 19 tháng 11 năm 1979.

Trong quá trình tham gia cách mạng và công tác tại địa phương, bà đã từng trải qua các chức vụ: Chuyên viên Văn phòng Quận ủy quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh, Trưởng ban Dân vận Đảng ủy rồi Bí thư Đảng ủy phường Bến Thành (Quận 1, TP. HCM); Ủy viên Ban Thường vụ Quận ủy, Viện trưởng Viện kiểm sát nhân dân Quận 1, Phó Chủ tịch Ủy ban nhân dân Quận 1; Phó Chủ tịch Hội Phụ nữ TP.HCM; Chủ tịch Hội Phụ nữ TP.HCM. Sau đó, bà được điều động giữ chức Phó Chủ nhiệm Ủy ban Dân số và Trẻ em tại Hà Nội.

Tháng 4 năm 2006, tại Đại hội Đảng Cộng sản Việt Nam toàn quốc lần thứ X (nhiệm kỳ 2006-2011), bà được bầu làm Ủy viên dự khuyết Ban Chấp hành Trung ương Đảng Cộng sản Việt Nam khóa X.

Từ tháng 10 năm 2007, bà giữ chức vụ Phó Chủ tịch thường trực Hội Liên hiệp Phụ nữ Việt Nam.

Tháng 5 năm 2009, bà được điều động tham gia Ban Chấp hành, Ban Thường vụ Tỉnh ủy và giữ chức Phó Bí thư Tỉnh ủy Vĩnh Long.[6]

Tháng 10 năm 2010, bà được bầu làm Bí thư Tỉnh ủy Vĩnh Long, thay người tiền nhiệm Trương Văn Sáu.

Tháng 3 năm 2015, theo Quyết định của Bộ Chính trị Ban Chấp hành Trung ương Đảng Cộng sản Việt Nam về việc điều động, phân công bà Đặng Thị Ngọc Thịnh, Ủy viên Trung ương Đảng, Bí thư Tỉnh ủy Vĩnh Long, thôi giữ chức Bí thư Tỉnh ủy Vĩnh Long, giữ chức Phó Chánh Văn phòng Trung ương Đảng Cộng sản Việt Nam.

Ngày 8 tháng 4 năm 2016, với tỷ lệ số phiếu tán thành là 91%, bà Đặng Thị Ngọc Thịnh trúng cử chức vụ Phó Chủ tịch nước Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam.[7]

Ngày 21 tháng 09 năm 2018, Chủ tịch nước Cộng hòa Xã hội chủ nghĩa Việt Nam Trần Đại Quang đột ngột qua đời[8]. Theo Hiến pháp Việt Nam 2013, bà trở thành Quyền Chủ tịch nước Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam ngay khi Trần Đại Quang qua đời.

Ngày 23/9/2018, thay mặt Ủy ban Thường vụ Quốc hội, Chủ tịch Quốc hội Nguyễn Thị Kim Ngân đã ký Thông báo số 317/TB-UBTVQH14 về việc thực hiện Quyền Chủ tịch nước Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam đối với bà Đặng Thị Ngọc Thịnh.[9]